Руководителю научно-методического
Центра по клинической лабораторной диагностике,
заведующему лаборатории проблем клинико-лабораторной диагностики
ММА им. И.М.Сеченова проф. Меньшикову В.В.
Уважаемый Вадим Владимирович!
Просим Вас разъяснить спорный вопрос в выборе оптимального метода
определения билирубина высоких концентраций в сыворотке крови у
новорожденных детей, в связи с тем, что результаты исследований в
различных лабораториях г. NN, пользующихся разными методиками, не совпадают.
(Ответ Лукичевой Т.И., внс НМЦ КЛД)
Лаборатория ДГБ 1 г. NN пользуется:
Унифицированной методикой определения билирубина в малом объеме сыворотки крови.
Модификация Т.Б Доброседовой и А.С.Циркиной, применяемая при выявлении гипербилирубинемии
у новорожденных в родильных домах и в детских лечебных учереждениях.
Методика описана в Справочнике по клинической химии В.Г.Голба и В.С.Камышникова, 1982 г.
Лаборатория городской больницы N1 пользуется:
Методикой определения билирубина по щелочному варианту,
которая является единой для определения билирубина для взрослых и детей.
Методика рекомендована главным специалистом нашей области.
Были проведены параллельные определения билирубина у новорожденных детей в
лабораториях ДГБ 1 и гор. больницы N1.
Результаты параллельного обследования:
| N |
ДГБ N1 |
ГБ N1 |
| N19 |
250 мкмоль/л |
185 мкмоль/л |
| N66 |
154 мкмоль/л |
111 мкмоль/л |
| N67 |
151 мкмоль/л |
111 мкмоль/л |
| 21.10 |
317 мкмоль/л |
281 мкмоль/л |
Расхождения в результатах составляют в среднем 50 мкмоль/л.
14 октября 1997 г. Были проведены параллельные исследования билирубина по контрольной сыворотке
HUMATROL P (015) с показателями билирубина 77 – 118 мкмоль/л, со средним значением 97.5 мкмоль/л в 3-х больницах.
Результаты исследований:
ДГБ N1
м-д Йендрашика
(микрометод) |
ОДБ
м-д Йендрашика |
ГБ N1
м-д Йендрашика
(щелочной вариант) |
| 99.4 мкмоль/л |
98.6 мкмоль/л |
76.8 мкмоль/л |
Наша лаборатория в 1996 г. принимала участие в международном контроле качества
LABQULITY, куда входило и определение билирубина.
| Дата |
Результат |
Среднее значение |
Сигма |
| 1.1996 |
31.0 мкмоль/л |
28.7 мкмоль/л |
2.3 мкмоль/л |
| 6.1996 |
48.0 мкмоль/л |
55.6 мкмоль/л |
3.8 мкмоль/л |
| 7.1996 |
14.0 мкмоль/л |
10.6 мкмоль/л |
2.2 мкмоль/л |
| 12.1996 |
44.0 мкмоль/л |
39.0 мкмоль/л |
2.9 мкмоль/л |
Врачи реанимационного отделения нашей больницы обслуживают все детские лечебные учереждения и роддома
г. NN круглосуточно, биохимические же исследования крови выполняются с 8.00 до 15.00 в лаборатории ГБ,
а с 15.00 до 8.00 – дежурным врачем нашей лаборатории.
Для того чтобы рузультаты определения билирубина, проводимые в 2-х лабораториях, совпадали,
главный специалист г.NN настаивает о переходе на метод определения билирубина по щелочному варианту,
несмотря на то, что для определения билирубина микрометодом необходимо 0.4 мл сыворотки крови,
а для определения билирубина по щелочному варианту – 0.7 мл. Учитывая что наши пациенты - грудные дети,
объем сыворотки, используемый в методике, имеет большое значение.
Нас интересуют следующие вопросы:
1. Можно ли использовать щелочной вариант для определения билирубина у новорожденных детей?
Из приведенных данных и опыта работы видно, что щелочной вариант завышает результаты, почему?
2. Какой метод является оптимальным для определения билирубина у новорожденных детей?
3. Каким образом нам решать спорные вопросы, если определение билирубина не входит
в программу контроля качества города и области, а результаты внутрилабораторного контроля качества,
получаемые в нашей лаборатории при проведении контроля правильности с сывороткой HUMATROL P,
являются близкими к наминальному значению?
Убедительная прозьба ответить на наши вопросы в письменном виде.
Описание методов прилагаются.
Подпись: Заведующая КДЛ ДГБ 1
ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИЛИРУБИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
(диазометод по Йендрашику, Клеггорну, Грофу)
РЕАКТИВЫ:
Кофеиновый реактив.
Физиологический р-р.
Диазосмесь:
А) Диазореактив 1.
Б) Диазореактив 2.
Перед работой смешивают 5.0 мл диазореактива (1) и 0.15 мл диазореактива (2).
| Реагенты |
Общий билирубин |
Прямой билирубин |
Контрольная проба |
| Сыворотка |
0.50 мл |
0.50 мл |
0.50 мл |
| Кофеиновый р-в |
1.75 мл |
|
1.75 мл |
| Физиологический р-р |
|
1.75 мл |
0.25 мл |
| Диазосмесь |
0.25 мл |
0.25 мл |
|
Прямой билирубин определяем через 10 мин.
Общий билирубин определяем через 20 мин.
Вслучае большой концентрации билирубина сыворотку нужно развести физраствором.
Полученный при этом результат умножают на разведение.
| Сыворотка |
Физ. р-р |
Разведение |
| 0.75 мл |
0.75 мл |
В 2 раза |
| 0.50 мл |
1.00 мл |
В 3 раза |
Смотрим на КФК-3: кювета 0.5 см
Против раствора сравнения
l= 540 нм
Мефан-8001:
Против раствора сравнения
Светофильтр N5
l=546 нм
МИКРОМЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИЛИРУБИНА СЫВОРОТКИ КРОВИ
(диазометод по Йендрашику, Клеггорну, Грофу в модификации Доброседовой и Циркиной)
РЕАКТИВЫ:
Кофеиновый реактив.
Физиологический р-р
Диазосмесь:
А) Диазореактив 1.
Б) Диазореактив 2.
Перед работой смешивают 5.0 мл диазореактива (1) и 0.15 мл диазореактива (2).
Сыворотку предворительно разводим физраствором.
| Сыворотка |
Физ. р-р |
Общий объем |
Разведение |
| 0.375 мл |
0.375 мл |
0.750 мл |
В 2 раза |
| Реагенты |
Общий билирубин |
Прямой билирубин |
Контрольная проба |
| Сыворотка развед. |
0.25 мл |
0.25 мл |
0.25 мл |
| Коф. р-в |
2.00 мл |
|
2.00 мл |
| Физ. р-р |
|
2.00 мл |
0.25 мл |
| Диазосмесь |
0.25 мл |
0.25 мл |
|
Прямой билирубин определяется через 10 мин.
Общий бмлмрубин определяется через 20 мин.
Полученный результат умножаем на 4, т.к. в пробирку попадает 0.125 мл сыворотки вместо 0.5 мл,
используемой в основной методике (0.125 мл составляют 1/4 от 0.5 мл).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИЛИРУБИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
(диазометод по Йендрашику в щелочной среде)
РЕАКТИВЫ:
Кофеиновый реактив-
125г кофеина бензойной кислоты и 125г уксуснокислого натрия растворяют на водяной бане в 700 мл воды,
после охлаждения доводят до 1 л.
Физиологический р-р – 0.9% раствора NaCl.
Диазосмесь:
A) Диазореактив 1.
5.0 г сульфаниловой кислоты растворяют в мерной колбе на 1л, добавляют 15 мл HCl
(r= 1.19) и доводят до 1л водой.
B) Диазореактив 2.
0.5 г азотистокислого натрия растворяют в воде до 100 мл. Срок хранения в холодильнике – 2 недели.
Перед работой смешивают 10.0 мл диазореактива 1 и 0.25 мл диазореактива 2. Смесь употребляют в течение 30 мин.
после приготовления.
Щелочная смесь.
100 г гранулированного NaOH и 350г сегнетовой соли (виннокислый K-Na) в 500 мл воды.
После охлаждения раствор доводят до 1л водой.
Раствор стойкий, срок хранения в полиэтиленовой посуде – 6 месяцев.
0.05 % раствор – 4.1 мл концентрированной HCl до 1л водой.
4 % раствор аскорбиновой кислоты.
| Реагенты |
Общий билирубин |
Прямой билирубин |
Контрольная проба |
| Сыворотка |
0.25 мл |
0.20 мл |
0.25 мл |
| Коф. р-в |
1.00 мл |
|
1.00 мл |
| 0.05 % HCl |
|
1.00 мл |
|
| Физ. р-р. |
|
|
0.25 мл |
| Диазосмесь |
0.25 мл |
0.25 мл |
|
Добавить через 1 мин.
| 4% раствор аскорбин к-ты |
|
0.05 мл |
|
Прибавить через 10 мин.
| Щелочная смесь |
0.50 мл |
0.50 мл |
0.50 мл |
Смотрим на ФЭКе: кювета 0.5 см
Против воды
l = 590 нм
Расчет:
Общего билирубина ( Еоп – Ек ) * 233 мкмоль/л
Прямого билирубина ( Еоп*1.25 – Ек ) * 233 мкмоль/л