ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИЙ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРАКТА

Введение

Урогенитальная сфера человека подвержена действию значительного количества патогенных и условно-патогенных микроорганизмов бактериальной, протозойной и вирусной природы. Среди них важное место отводится хламидиям (Chlamydia spp.), нейссериям (Neisseria gonorrhoea), трихомонадам (Trichomonas vaginalis), микоплазмам (Mycoplasma spp и Ureaplasma urealyticum), гарднереллам (Gardnerella vaginalis) и т.д. Данные возбудители являются причиной разнообразных заболеваний и, как следствие, дисфункций репродуктивной системы, мочевыводящих путей, антенатальных и постнатальных инфекций. Разработка и внедрение современных методов диагностики урогенитальных инфекций является весьма актуальной задачей отечественной медицины1.

1. Урогенитальный хламидиоз

Chlamydia trachomatis (сем. Chlamydiaceae) относится к наиболее распространенным возбудителям урогенитальных инфекций. Данный вид не способен синтезировать АТФ, ГТФ и не может размножаться вне клеток хозяина. Хламидиозы являются одной из причин уретритов, сальпингитов, простатитов, цервицитов, эпидидимитов, проктитов, пельвиоперитонитов и других заболеваний. По данным Всемирной организации здравоохранения в развитых странах среди больных с вышеперечисленными клиническими синдромами хламидийная инфекция выявляется у 15-80% обследуемых. Инфицирование хламидиями приводит к повышению антенатальной смертности плода, увеличению частоты преждевременных родов, а также возникновению трахомоподобных конъюнктивитов и интерстициальных пневмоний у новорожденных. Заражение С. trachomacis является основной первичной причиной бесплодия у женщин — до 70% бесплодных женщин с сальпингитами являются носителями хламидий.

В настоящее время существуют достаточно эффективные и доступные средства лечения хламидиоза. Но для успешной терапии необходима своевременная и качественная диагностика данного заболевания, учитывая бессимптомное течение хламидиоза в большинстве случаев и сходство в симптоматике с другими урогенитальными инфекциями.

Традиционным и наиболее широко используемым методом обнаружения С. trachomatis в клиническом материале (как правило, соскоб из уретры или цервикального канала) является использование флюоресцирующих антител - реакция прямой иммунофлюоресценции (РИФ). Преимуществами метода РИФ, помимо простоты и скорости проведения анализа, являются возможность оценить качество биологического материала, представленного для анализа, дополнительная оценка ряда цитологических аспектов (например,внутриклеточной локализации возбудителя). Целесообразно использовать метод РИФ в сочетании с другими, в первую очередь,иммуноферментным анализом.

fig941.gif (28999 bytes) fig940.gif (32440 bytes)
Рисунок 1. Микрофотография колонии Mycopidsma hominis
в
мазке-отпечатке из шейки матки.
Рисунок 2. Две клетки
Ureaplasma urealyticum.
Плоский эпителий

Известный и зарекомендовавший себя во многих учреждениях здравоохранения диагностический препарат для выявления Chlamydia trachomatis - «ХламиСлайд» (новое коммерческое название («С.Т.Д.-тест» хламидия / «S.T.D.-test» Chlamydia trachomatis)отличается высокими показателями чувствительности, специфичности и воспроизводимости2 .

Пример использования данного препарата приводится ниже.

1. Подготовка материала.

Взятый соскобный материал, аспират простаты помещают на луночное стекло, равномерно распределяя тонким слоем. Затем стекла высушивают на воздухе.

Фиксация материала осуществляется путем погружения препарата в раствор этанола на 30 секунд. После фиксации препарат высушивают на воздухе. Хранить или транспортировать фиксированный препарат желательно при температуре ниже 0°С, не допуская конденсации влаги. Обрабатывать мазок флюоресцирующими антителами рекомендуется в течение 7 дней.

2. Приготовление реагентов.

Лиофилизованные антитела «ХламиСлайд», меченные флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), разводят в 1 мл дистиллированной воды. Полученный раствор можно хранить в темном месте при температуре +4-+8°С в течение 10 дней. Допускается однократное замораживание.

3. Нанесение реагента на препарат.

30 мкл раствора диагностических антител с помощью автоматической пипетки наносят на участок предметного стекла с фиксированным биоматериалом. Перед нанесением реагента рекомендуется убедиться в наличии материала на стекле. С помощью наконечника пипетки или запаянной пастеровской пипетки равномерно распределяют реагент по всей поверхности зоны с материалом.

4. Инкубация препаратов.

Препараты с нанесенным на них реагентом инкубируют во влажной камере при температуре от +25 до +37°С в течение 15-20 мин, Не допускать высыхания реагента!

5. Промывание стекол.

Окрашенные препараты тщательно промывают в дистиллированной воде, при отсутствии дистиллята — под слабой струей водопроводной воды не менее 1 мин, остатки воды удаляют с краев стекла с помощью фильтровальной бумаги и высушивают.

6. На препарат наносят каплю монтирующей жидкости (глицерин, разведенный в 0.1 М Трис-буферном растворе, рН 8.5, в отношении 2:1, или в 0.2 М К2НРО4, рН 9.0-9.4, в том же соотношении).

7. Покрывают препарат обезжиренным покровным стеклом.

8. Капают на покровное стекло нефлюоресцирующее иммерсионное масло.

9. Просматривают препарат в люминесцентном микроскопе с системой фильтров, рассчитанных на выявление свечения ФИТЦ (максимальная длина волны возбуждения 490 нм, средняя длина волны излучения - 520 нм). Увеличение в 400-500 раз, а при необходимости уточнения деталей объекта — до 1000 раз с использованием иммерсионного масла. Настоятельно рекомендуем применение водно-иммерсионных объективов ВИ 60x (при их использовании необязательно применение покровных стекол, дорогостоящего канцерогенного иммерсионного масла). К тому же, после ополаскивания дистиллятом окрашенного препарата не возникает необходимости в подсушивании (снижение количества артефактов).

Рекомендуем просматривать препарат сразу же после приготовления. Если такой возможности нет, то смонтированные препараты можно сохранять при температуре +2-+8°С не более 24 ч (обязательно в темном месте).

Высокая специфичность диагностических антител «ХламиСлайд» позволяет выявлять элементарные тельца хламидий, расположенные внеклеточно (изумрудные ярко-зеленые образования с ровными краями округлой формы). Можно наблюдать также и ретикулярные тельца, размеры которых в 4-5 раз больше элементарных. Внутриклеточные включения наблюдают не более, чем в 5% случаев. Любой флюоресцирующий метариал неправильной формы или другого цвета, а так же имеющий неярко-зеленую или желто-зеленую окраску, рассматривается как артефакт. Следует помнить, что диагностику можно проводить только в том случае, если при просмотре препарата видны окрашенные в красный цвет клетки цилиндрического эпителия. Изучение в люминесцентном микроскопе элементарных телец показало, что перефокусировка приводит к возникновению по периферии элементарного тельца четкого дифракционного кольца (кольца Фринеля).

Отрицательным диагноз считается при наличии красных эпителиальных клеток, в то время как хламидий не определяются. Примечание: растворенные реагенты следует хранить при температуре +2-+8°С и перед применением выдержать при комнатной температуре не менее 5 мин.

2. Урогенитальные микошазмозы.

Человек является хозяином по крайней мере 10 видов микоплазм, в том числе избирательно поражающих урогенитальную систему- Mycoplasma hominis, М. genitalium, Ureaplasma urealyticum. Урогенитальный микоплазмоз (уреаплазмоз) относится к категории болезней, передаваемых половым путем. Трудность диагностики, распространенность микоплазмозов и неадекватность лекарственной терапии привели к преобладанию этих инфекций над классическими венерическими заболеваниями. Урогенитальные микоплазмозы оказывают значимое влияние на развитие целого ряда полиэтиологических воспалительных заболеваний: негонококкового уретрита, простатита, острого и хронического сальпингита, эндометрита, аднексита; микоплазмы поражают почки и верхние отделы мочевыводящих путей. Mycoplasma hominis способна вызывать септические артриты3Обсемененность микоплазмами является серьезным фактором риска при трансплантации почки и при стероидной терапии. Инфицированность микоплазмами во время беременности приводит к выкидышам в ранние сроки, обсеменению плаценты, преждевременным разрывам плодных оболочек, сепсису и менингиту. Микоплазмы занимают одно из важнейших мест среди возбудителей внутриутробных инфекций человека. Обсуждается возможность их тератогенного воздействия. По последним данным, U. urealyticum способна вызывать нарушения митоза в лимфоцитах человека4. Факторами, усиливающими потенциальную опасность осложнений при Инфицировании условно-патогенными микоплазмами, являются нарушение иммунного статуса организма, беременность, аборт, оперативное вмешательство и т. д.

Предложенная для разработки тест-система основана на выявлении микоплазменных антигенов в мазках со слизистой урогенитального тракта, моче, семенной жидкости с помощью специфических антител, меченных ФИТЦ. Наличие в составе поверхностных антигенов М. hominis интегрального белка 102 kD, идентичного у представителей различных серотипов, позволило получить антитела, реагирующие со всеми этими серотипами, несмотря на вариабельность их антигенной структуры. Более сложную задачу представило получение антител требуемой специфичности в отношении U. urealyticum. Известные на сегодня 16 серотипов уреаплазм относятся к двум серогруппам (А и В); антигенные различия между отдельными серотипами настолько существенны, что потребовался набор из нескольких типоспецифических сывороток, способных охватить весь спектр типоспецифических антигенов.

Пример использования данных препаратов приводится ниже,

1. Подготовка материала.

Взятый соскобный материал, центрифугат мочи и т. д. помещают на луночное стекло, равномерно распределяя тонким слоем. Затем стекла высушивают на воздухе.

Процедуры фиксации материала, окраски, промывки, мониторирования и просмотра идентичны использованию препарата «Хлами-Слайд». Существенно отличается раздел трактовки результатов:
Диагностические антитела «МикоСлайд» («С.Т.Д.-тест» микоплазма / «S.T.D.-test» Mycoplasma hominis) и «Уреаслайд» («С.Т.Д.-тест» уреаплазма / «S.T.D.-test» Ureaplasma ureaiyticum) позволяют выявлять как свободные, расположенные внеклеточно микоплазмы и уреаплазмы, так и паразитирующие на мембранах клеток хозяина микроорганизмы данных видов. Диагноз микоплазмоза (уреаплазмоза) устанавливает клиницист по совокупности клинической симптоматики, обнаружении паразитирующих микроорганизмов. Микоплазмы выглядят в виде кокков, кокко-бацилл, тяжей, нитей и являются чрезвычайно полиморфными. Любой флюоресцирующий материал, имеющий желто-зеленую окраску, рассматривается как артефакт. Следует помнить, что диагностику можно проводить только в том случае, если при просмотре препарата видны окрашенные в красный цвет эпителиальные клетки. Другие микроорганизмы выглядят как красно-оранжевые образования.

Отрицательным диагноз считается при отсутствии специфического свечения.


Литература

1. Приказ МЗиМП РФ №286 от 7 декабря 1993 г. «О совершенствовании контроля за заболеваниями, передаваемыми половым путем».

2. Мазурчук С. А. Набор для выявления хламидийной инфекции. Патент РФ №2079263.10.05.97 ( misttirr@com2com.ru )

3. Lucrell L. М. et al. Mycoplasma hominis septic arthritis, Clin. Infect, Dis. 19: 1067-1070 (1994).

4. Cunha R. A. F. et al. Ureaplasma urealyticum clastogenic effects. Bras. J. Med. Biol. Res. 30 (6) 749-757191997).

( http://www.epub.org.br./bjmbr/yer1997/v30-6/2601c.htm )

 

 








НОВОСТИ АССОЦИАЦИЯ ОБРАЗОВАНИЕ НАУКА БИБЛИОТЕКА НОРМАТИВЫ ОБЪЕДИНЕНИЯ ОСНАЩЕНИЕ КАЧЕСТВО

YACA @Mail.ru